高效液相色譜是目前應(yīng)用最多的色譜分析方法,高效液相色譜系統(tǒng)由流動相儲液體瓶、輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器和記錄器組成,其整體組成類似于氣相色譜,但是針對其流動相為液體的特點(diǎn)作出很多調(diào)整。HPLC的輸液泵要求輸液量恒定平穩(wěn);進(jìn)樣系統(tǒng)要求進(jìn)樣便利切換嚴(yán)密;由于液體流動相粘度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于氣體,為了減低柱壓高效液相色譜的色譜柱一般比較粗,長度也遠(yuǎn)小于氣相色譜柱。HPLC應(yīng)用非常廣泛,幾乎遍及定量定性分析的各個領(lǐng)域。
高效液相色譜儀的系統(tǒng)由儲液器、泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀等幾部分組成。儲液器中的流動相被高壓泵打入系統(tǒng),樣品溶液經(jīng)進(jìn)樣器進(jìn)入流動相,被流動相載入色譜柱(固定相)內(nèi),由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù),在兩相中做相對運(yùn)動時,經(jīng)過反復(fù)多次的吸附-解吸的分配過程,各組分在移動速度上產(chǎn)生較大的差別,被分離成單個組分依次從柱內(nèi)流出,通過檢測器時,樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號傳送到記錄儀,數(shù)據(jù)以圖譜形式打印出來。
1、樣品準(zhǔn)備:樣品準(zhǔn)備對HPLC分析結(jié)果至關(guān)重要。確保樣品純凈,并根據(jù)所需分離目標(biāo)選擇適當(dāng)?shù)奶崛?、凈化和濃縮方法。
2、色譜柱選擇:根據(jù)需要分離的化合物特性選擇合適的色譜柱??紤]分離機(jī)理、柱填料類型、柱尺寸和固定相親水/疏水性等因素。
3、流動相選擇:根據(jù)待分離物的極性選擇合適的流動相組合。優(yōu)化溶劑體系,平衡分辨率和保留時間。
4、校準(zhǔn)曲線:為了定量分析,建立準(zhǔn)確的校準(zhǔn)曲線并進(jìn)行適當(dāng)?shù)尿?yàn)證。使用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品制備一系列濃度點(diǎn),并確定響應(yīng)因子或檢測靈敏度。
5、進(jìn)樣方法:選擇適當(dāng)?shù)倪M(jìn)樣方法,如自動進(jìn)樣器或手動進(jìn)樣。確保進(jìn)樣量恒定且符合儀器要求。
6、溫度控制:一些分析可能需要在特定溫度下進(jìn)行。使用恒溫箱或列溫控制器確保色譜柱處于穩(wěn)定的溫度條件下。
7、檢測器設(shè)置:根據(jù)目標(biāo)化合物的特性選擇合適的檢測器。常見的檢測器包括紫外-可見光譜檢測器(UV-Vis)、熒光檢測器、電化學(xué)檢測器等。
8、數(shù)據(jù)分析:正確解釋和分析HPLC數(shù)據(jù)是確保準(zhǔn)確結(jié)果的關(guān)鍵。使用合適的軟件進(jìn)行峰識別、積分和定量計(jì)算。
9、儀器維護(hù):定期進(jìn)行儀器維護(hù)和校準(zhǔn),包括清洗色譜柱、更換流動相溶劑和檢查液壓系統(tǒng)等。